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LA MACCHINA DI CONSERVAZIONE IPOTERMICA CON PERFUSIONE IN OSSIGENO IPERBARICO (HMP-HBO)
(brevetto Centro iperbarico srl n. xxxx)
Introduzione, storia, fisiologia, tecnica della conservazione, sistemi di perfusione, effetto della temperatura, soluzione di conservazione, effetto della soluzione, ruolo dell’ossigeno, conservazione ipotermica con perfusione in ossigeno iperbarico (HMP-HBO)
Nelle ultime decadi il trapianto di fegato è diventato una terapia di routine per quei pazienti che soffrono di patologie del fegato negli stadi terminali. Al fine di far fronte al tempo intercorrente tra l’epatectomia e il trapianto, il fegato oggigiorno viene preservato prevalentemente con la metodica della conservazione fredda statica (CS). Il fegato, dopo l’epatectomia, viene posto in contenitori freddi statici, immerso in una soluzione di conservazione dell’Università del Wisconsin (UW) in ghiaccio sciolto a 0-4 C°. Tale temperatura riduce del 90-95% il metabolismo cellulare. La UW soluzione permette di conservare il fegato del donatore per 12/18 ore in un contesto clinico e addirittura mantenerlo per oltre 48 ore in condizioni sperimentali. La maggior parte dei fegati usati per il trapianto provengono da donatori con morte cerebrale avvenuta; mentre i fegati proveniente da donatori con battito cardiaco assente o marginale si presume siano di cattiva qualità e raramente sono usati per il trapianto poiché ci si aspetta una diminuzione dell’attecchimento dell’organo e maggiori complicanze tecniche associate. Per far fronte all’attuale carenza di donatori di fegato, la comunità scientifica auspica la realizzazione di macchine da perfusione trasportabili basate sulla conservazione dinamica.
Verso la fine degli anni ’60 Belzer & Co., Slapak & Co., BrettSchneider & Co. hanno dimostrato che con la macchina ipotermica a conservazione dinamica con perfusione continua (HMP) del fegato in ambiente sperimentale i risultati potevano essere comparati e persino considerati migliori di quelli con la conservazione statica (CS). Nel 1986 D’Alessandro & Co. e, più tardi, Pienaar & Co. hanno ottenuto una buona qualità di trapianto di fegato canino dopo la conservazione con HMP. A dispetto dell’esperienza efficace e di successo ottenuta con la perfusione continua dei reni e a dispetto dei risultati ottenuti da Pienaar con il fegato, l’HMP non è ancora divenuta una procedura standard nella pratica quotidiana..
Il fegato è perfuso sia dall’arteria epatica (HA) che dalla vena porta (PV). La PV contribuisce ai 2/3 della perfusione totale del fegato, con una pressione media di 12 mmHg irrora le cellule epatiche con il sangue proveniente dall’area splancnica e intestinale. L’arteria epatica, con una pressione pulsante di 120-80 mmHg, irrora i sinusoidi epatici, le pareti dei vasi e l’albero biliare; è essenziale per il mantenimento della struttura dei vasi e dell’integrità dei dotti biliari. Il sangue apportato da entrambi i sistemi attraverso i sinusoidi lascia il fegato attraverso la vena epatica la quale affluisce nella vena cava inferiore.
TECNICA DELLA CONSERVAZIONE IPOTERMICA CON PERFUSIONE (HMP)
I risultati migliori nella sperimentazione di conservazione epatica furono quelli ottenuti da Pienaar & Co. con la perfusione pulsatile della sola vena porta: si ebbero 7 cani su 8 sopravvissuti dopo 7 o più giorni dal trapianto di un fegato conservato per 72 ore in una soluzione UW-MP. Anche Yamamoto & Co. ottennero con successo una conservazione di fegato di maiale per 72 ore con il metodo HMP, tuttavia essi usarono una perfusione continua della vena porta. Un confronto fra i due esperimenti è difficile, in quanto Yamamoto non valutò i risultati in un modello trapiantato come fece Pienaar, ma valutò la vitalità del fegato su un modello isolato di fegato perfuso (IPL). Negli anni il modello IPL è stato considerato il modello rappresentativo di riperfusione nonostante l’assenza di cellule sanguigne e cellule del sistema immunitario. In questo modo è stato dimostrato che la conservazione del fegato in condizioni di ipotermia è possibile sia con perfusione continua che con perfusione pulsatile attraverso la vena porta. Recentemente Compagnon & Co. hanno confrontato le diverse vie di perfusione in un modello di fegato di ratto. E’ stato fatto un confronto fra le singole per fusioni della vena porta e dell’arteria epatica e poi è stata testata la vitalità del fegato di ratto in un modello IPL. La perfusione attraverso la vena porta si è dimostrata essere superiore alla CS statica e la singola perfusione attraverso l’arteria epatica si è dimostrata essere meno benefica. Le caratteristiche della per fusione con HMP sono: pressione di perfusione portale da 2 a 25 mmHg, il flusso 0.14 a 4.8 ml/min/g. La perfusione arteriosa potrebbe essere rappresentata preferibilmente in maniera pulsatile a 60/40 mmHg e a una frequenza di 60 BPM
Ai fini della conservazione ipotermica con perfusione (HMP) del fegato è importante risolvere i problemi di raffreddamento, ossigenazione e perfusione dinamica. Per il raffreddamento, è necessario effettuare una scelta tra il raffreddamento in linea del tessuto perfuso tramite uno scambiatore di calore o il raffreddamento dell’intero ambiente posizionandolo in refrigeratore o in uno spazio freddo. L’ossigenazione si effettua utilizzando un ossigenatore in linea o tramite l’ossigenazione della superficie dell’organo. Per la perfusione dinamica sono state simulate sia la doppia perfusione attraverso la vena porta e l’arteria epatica che la perfusione solo attraverso la vena porta. La perfusione arteriosa si raggiunge generalmente attraverso una pompa peristaltica. Le pompe peristaltiche utilizzano il principio di avanzamento del fluido tramite compressione e decompressione dei tubi, attraverso un tubo flessibile deformato. Un ulteriore vantaggio di tale principio è che la soluzione di conservazione non ha un contatto diretto con la testa della pompa assicurando così una situazione di sterilità. La conseguenza del principio di avanzamento è che la pompa peristaltica è una pompa flusso-guidata. Qualsiasi disturbo del flusso dovuto ad un’ostruzione nel circuito, causerà un indesiderato aumento di resistenza e produrrà un’elevata pressione di perfusione. La perfusione della vena porta si ottiene sia tramite una pompa peristaltica sia tramite una perfusione per gravità. Per l’HMP dei reni esistono ora numerosi sistemi che utilizzano pompe peristaltiche, ad esempio la macchina di perfusione dei reni Gambro (Gambro, Stoccolma, Svezia), la macchina di perfusione dei reni RM3 (Waters Medical Systems, Rochester MN, USA) e il successore del MOX-100. I macchinari sopra menzionati consistono fondamentalmente in un camera centrale dove viene posizionato l’organo e un sistema di pompaggio che dirige la soluzione di conservazione da un contenitore ai reni in maniera pulsatile. In entrambi i sistemi la soluzione di conservazione è consegnata all’organo da una pompa a tubo deformato. L’ipotermia si realizza tramite raffreddamento con ghiaccio. L’ossigenazione viene raggiunta tramite una combinazione di aria dell’ambiente con un ossigenatore di membrana nella macchina (sistema Waters) o tramite una sovrapressione nella camera centrale utilizzando una piccola quantità di ossigeno medicale (sistema Gambro). L’altro metodo sarebbe la perfusione per gravità che, in accordo con la legge di Bernoulli, si basa sul principio che la pressione alla quale l’organo è perfuso è direttamente correlata con l’altezza alla quale è posto un contenitore aperto. Ad esempio se un contenitore con soluzione UW è situato 15 cm sopra l’organo (h), la pressione idrostatica (p) sarà: p=rho*g*h=11,8 mmHg dove rho è la gravità specifica di UW e g il coefficiente gravitazionale. Secondo questo principio una bassa pressione di perfusione potrebbe essere facilmente applicata ma è difficilmente utilizzabile al di fuori del laboratorio. Un sistema portatile facile da maneggiare che includa queste caratteristiche non è ancora disponibile in commercio.
Quando con l’HMP si intende simulare la fisiologica circolazione epatica devono essere presi in considerazione due aspetti: 1) l’effetto della temperatura, in quanto l’ipotermia altera la compliance vascolare e 2) l’effetto della soluzione, in quanto soluzioni a composizione diversa e con diversa proprietà di conservazione, alterano le condizioni reologiche.
Uno dei fattore chiave nella conservazione del fegato è l’ipotermia. L’ipotermia rallenta il metabolismo cellulare, questo rallentamento viene definito dal principio di Van’t Hoff, espresso dalla formula Q10=(k1/k2), con Q10 che è il coefficiente di Van’t Hoff per una variazione di temperatura di 10 gradi e k1 e k2 i dati di reazione alle temperature, rispettivamente, t1 e t2. Il coefficiente Q10 risulta essere due a una temperatura di 4°C, cioè il 10% in meno rispetto ad un Q10 a 37°C. Abbassando la temperatura da 37 a 4°C si ha una vasocostrizione dei vasi epatici e un aumento della resistenza al flusso.
L’ipotermia diminuisce l’attività della CaATP-asi virtualmente a zero, inducendo la vasocostrizione. Come conseguenza della diminuzione del calibro dei vasi, secondo la legge di Poiseuille, la resistenza aumenta con la quarta potenza del diametro. Fortunatamente si sa che, dalla perfusione ipotermica dei reni, questa vasocostrizione nella maggior parte dei casi avviene nei primi 30’ di perfusione.
In aggiunta le basse temperature alterano anche le caratteristiche fisiologiche e biochimiche delle cellule con la perdita del gradiente ionico transmembrana e delle funzioni di barriera della membrana. A causa di questa aumentata sensibilità delle cellule endoteliali al danno, fattori dannosi come una temperatura molto elevata, molto bassa o una rapida variazione causano stress che dovrebbero essere evitati durante la conservazione dell’organo.
La soluzione di conservazione dell’Università del Wisconsin usata per l’HMP (UW-MP), sviluppata da Belzer e Southard, è una soluzione acellulare usata da molti centri per l’HMP, poiché include gluconato per prevenire il rigonfiamento cellulare dato dall’ipotermia, il fosfato per prevenire l’acidosi intracellulare, il glutatione e l’allopurinolo per inibire la formazione dei radicali liberi dell’ossigeno, l’adenosina per stimolare la sintesi dell’ATP e infine amido idrossietilico per mantenere la pervietà dei vasi e prevenire l’edema. La soluzione UW-MP si differenzia dalla soluzione UW per la conservazione fredda statica (UW-CS): nella UW-MP il gluconato è incluso come un “impermeant” mentre nella CS come “lactiobionate”. Pienaar e Co., utilizzando la soluzione UW-MP, hanno riscontrato la sopravvivenza del fegato di cane dopo 72 ore nel 90% dei casi. Esperimenti di successo sono stati descritti anche da Boudjema & Co., Kim & CO., Yamamoto & Co. La soluzione UW-MP ha l’aspetto negativo di aumentare notevolmente la viscosità per la presenza dell’amido idrossietilico (sostanza ad alto peso molecolare). Recentemente si è scoperto che il fattore determinante non è tanto la viscosità della soluzione ma lo stato di aggregazione dei globuli rossi durante il primo lavaggio che dipende a sua volta dall’amido idrossietilico. Per eliminare gli effetti negativi dell’alta viscosità e/o dell’eccessiva aggregazione dei globuli rossi si raccomanda di effettuare un iniziale lavaggio con una soluzione a bassa viscosità che prevenga l’aggregazione. Ciò può essere fatto con un’immersione nella soluzione Ringer-lattato o EuroCollins o anche con una soluzione UW senza amido idrossietilico. In seguito l’organo dovrebbe essere perfuso con la soluzione di conservazione secondo il metodo di conservazione HMP.
La viscosità del sangue a 37°C è approssimativamente di 4x10-3 Pascal ed è inversamente proporzionale allo shear rate (attrito). La viscosità del sangue diminuisce nei piccoli capillari, dove il rapporto cellule del sangue/plasma è in favore del plasma, per la minore frizione contro le pareti (effetto Fhareus-Lindqvist). In un fluido acellulare la viscosità non lineare è assente e la viscosità si avvicina ai valori di viscosità dell’acqua pura a 4°C, che è approssimativamente 2x10-3 Pascal. In una soluzione UW,comunque, sono presenti colloidi ed è stato dimostrato che tali colloidi causano una componente non lineare nella viscosità. È stato anche dimostrato che la viscosità della soluzione UW a 4°C è 11x10-3 Pascal, cioè tre volte superiore a quella del sangue. Dalla legge di Poiseuille P=[8nL/3,14r4],dove L corrisponde alla lunghezza del condotto cilindrico e r al raggio, si può concludere che la differenza di pressione P e il flusso risultante Q sono proporzionali alla viscosità dinamica n. In altre parole, se, a parità di pressione, viene usato un fluido con viscosità tre volte maggiore, ne risulta un flusso tre volte minore. Questo deve essere tenuto in considerazione quando si devono definire le pressioni e il flusso nella perfusione ipotermica del fegato.
RUOLO DELL’OSSIGENO NELLA CONSERVAZIONE IPOTERMICA
Fujita & Co. hanno stabilito che la quantità di ossigeno consumata da un metabolismo rallentato è una funzione logaritmica della temperatura. Durante la riperfusione ai mitocondri è necessaria una elevata quantita’ di ossigeno. Utilizzando la perfusione continua della vena porta con temperature variabili tra i 5 e 37°C, essi hanno misurato un consumo di ossigeno (VO2), dipendente dalla temperatura T, di : VO2=0.21x10
Poiché la relazione tra consumo di ossigeno e temperatura è logaritmica, il consumo di ossigeno diminuisce al decrescere della temperatura ma non si azzera mai a temperature comprese fra 0 e 4°C. A 4°C il metabolismo epatico richiede un’ossigenazione di 0.27 µmol/min/g, ciò implica che durante la perfusione ipotermica è necessario un certo apporto di ossigeno Questa scoperta è confermata da uno studio comparativo di Fujita & Co. su soluzioni di conservazione cariche di ossigeno in comparazione a quelle senza ossigeno, tale studio ha dimostrato che a una saturazione di ossigeno del 95% c’è una buona vitalità dell’organo, mentre una totale mancanza di ossigeno causa danni cellulari e specialmente danni alle cellule endoteliali..
L’uso di anti-radicali liberi dell’ossigeno nella soluzione di conservazione a freddo, ha un effetto benefico sulla vitalità dell’organo dopo il trapianto.
LA MACCHINA DI CONSERVAZIONE IPOTERMICA CON PERFUSIONE IN OSSIGENO IPERBARICO (HMP-HBO)
Gli stimoli offerti da questi studi sperimentali hanno portato il Centro iperbarico srl, in collaborazione con il Prof. Michele Rubbini dell’Università di Ferrara, alla ideazione, brevettazione e sperimentazione di un nuovo sistema di perfusione ipotermica per il fegato umano trasportabile, facile all’uso che utilizzasse la perfusione e l’ossigenazione iperbarica. Il sistema è stato sperimentato anche dal prof. Davide Trerè dell’Università di Bologna.
I tre punti chiave nella conservazione del fegati con HMP-HBO sono il tipo di soluzione di conservazione, le caratteristiche dinamiche della perfusione e l’apporto di ossigeno. I migliori risultati sono stati ottenuti con la macchina che usa la soluzione di conservazione dell’Università del Wisconsin (UW-MP), nonostante abbia una viscosità maggiore rispetto al sangue a 37°C determinando un flusso minore alle pressioni fisiologiche. Per la perfusione epatica, l’approccio migliore è quello fisiologico: dal lato arterioso una profusione pulsatile e dal lato portale una perfusione continua. La pressione scelta per la HMP-HBO è più bassa rispetto a quella fisiologica per prevenire possibili danni alle cellule endoteliali in condizioni ipotermiche, ad esempi: perfusione arteriosa pulsatile a 60/40 mmHg, con frequenza di 60 BPM e perfusione portale con pressione di 2 a 25 mmHg (ottimale 8 mmHg), flusso 0.14 a 4.8 ml/min/g. In merito alla ossigenazione, la pressione parziale dell’ossigeno (Pa) minima è inversamente proporzionale al flusso normalizzato (ml/min/g di fegato). Per permettere un’applicazione clinica efficace dell’HMP-HBO è necessario che la tecnica sia compatibile con le procedure di operazione standard chirurgiche. La semplice tecnica della conservazione statica a freddo, in quanto procedura standard prediletta, è stata usata come base per il disegno del sistema HMP-HBO, il quale ne incorporare la stessa maneggevolezza, procedure e materiali con l’aggiunta di un semplice sistema a doppia pompa. Il sistema HMP-HBO è portatile per permettere facili trasporti ed è in parte monouso. Come suggerito da Miosh, il peso target è circa 23kg. Un ultimo importante requisito per del sistema HMP-HBO per il fegato è il periodo di lavoro potenzialmente illimitato, inclusa la capacità di condizionamento per mantenere le condizioni ipotermiche (o, eventualmente, ipertermiche) entro il range di meno 10, più 40 °C per tutto il tempo necessario. Questi criteri fanno aderire il sistema HMP-HBO per il fegato al concetto internazionale già esistente di “organ sharing”. Studi sono in atto per verificare la possibilità di un utilizzo efficace di questa tecnica inserendole nella pratica clinica quotidiana e sostanzialmente per contribuire a migliorare la qualità del fegato donato e la sua vitalità accorciando le liste di attesa per i trapianti, migliorando la ripresa dopo trapianto.
COLLABORAZIONI
- Prof. Michele Rubbini, Università degli Studi di Ferrara
- Prof. Davide Trerè, Università degli studi di Bologna
BIBLIOGRAFIA
1. “Liver Preservation Using Hyperbaric Oxygenated Perfusion”, International Conference on Diving and Hyperbaric Medicine, Barcellona 7-10 settembre 2005
2. Longobardi P., Rubbini M, Semprini G “Preservation of livers to be transplanted using hyperbaric oxygen perfusion: experimental study on animals” 32° EUBS Annual Meeting, Bergen 23-26 agosto 2006
3. M. Rubbini, P. Longobardi, A. Rimessi, P. Pinton, A. Morri, G. Semproni, P. Pistone, L. Volpinari “Una nuova macchina trasportabile per la conservazione mediante perfusione iperbarica ossigenata del fegato da trapiantare”. Chirurgia Italiana 2007, vol. 59, n.5, pp. 723-734. (pubblicazione)